В лаборатории Нейробиологии ИФМиБ КФУ (руководитель – Рустем Хазипов) завершает работу уникальная для нашей страны школа молодых ученых «От нейрона к мозгу», открывшаяся 19 октября.
В работе школы – и со стороны преподавателей, и со стороны школьников – принимают участие сотрудники портала «Нейроновости».
Само мероприятие рассчитано на неделю, но при этом лекционный день всего один: 19 октября школьники слушали лекции с 9 утра и до 6 вечера.
Но и в лекционный день, и в последующие дни участников школы ориентировали, в первую очередь, на практику. Уже со второго дня они разбились на небольшие группы и сами осваивали новейшие электрофизиологические и оптические технологии нейробиологических исследований: от регистрации активности клеток, от гистологических срезов коры и гиппокампа до регистрации активности мозга живого животного.
«Наша идея была проста: в мире (и в России) много лекционных школ, много конференций, но почти нет мероприятий для молодых учёных (от старших студентов до аспирантов и кандидатов наук), где они могли бы попробовать современные методы нейронаук руками. Поэтому мы второй год уже проводим школу, где лишь один лекционный день, а остальное время ребята пробуют практическую науку: осваивают в небольших группах наши установки, а потом делают и защищают собственный научный проект. Так они понимают, чем живёт реальный нейробиолог», — сказал один из идеологов и руководителей школы, Марат Минлебаев, кандидат медицинских наук, научный сотрудник Лаборатории нейробиологии КФУ, Charge de recherche INMED/INSERM U901 (Марсель, Франция).
Приглашаем вас ознакомиться с небольшим «дневником» мероприятия, который вела заместитель главного редактора портала «Нейроновости» Анна Хоружая.
День 1/2. Потенциалы в действии
Мы начинаем небольшую и, можно сказать, hand made-рубрику о том, что происходит в данный момент на уникальной в России профильной школе по нейробиологии, где у участников есть возможность не только послушать лекции, но и самолично прикоснуться руками к настоящей нейронауке. А вашими глазами буду я, участник школы и зам. главного редактора Анна Хоружая. Хочу сразу сказать, что в этих постах мы не претендуем на наукообразность, описание тончайших подробностей процесса и беспристрастную оценку. Это будет потом, в общем отчёте, а пока что, если вам интересно, выставляем на суд личное мнение в простом изложении.
На самом деле днём 1 официально нужно считать первый лекционный день школы, но я пойду от начала практики.
С самого вчерашнего утра нас всех распределили на 4 группы по 3-4 человека в каждой и расставили по четырём установкам. Первые две предназначались для in-vitro исследований — мы изучали срезы мозга уже мёртвой молодой (до 14-15 дня жизни) мышки или крысы, а на третьей и четвёртой анализировали поведение клеток мозга живых животных. Считаю, что мне повезло оказаться в первой группе, потому что мы начали с самой первой установки «в пробирке» и идём, так сказать, от меньшего к большему.
Чем мы занимались вчера? Во-первых, учились пэтчить. В смысле клампить. В смысле прикрепляться тончайшей полой стеклянной трубочкой с электродом внутри к мембране клетки и фиксировать её жизнедеятельность. Метод получил название пэтч-кламп (англ. patch — фрагмент, clamp здесь — фиксация).
А во-вторых, учились регистрировать характерную для нервных клеток гиппокампа долговременную потенциацию при открытии глутаматных рецепторов, которые пропускают кальций в клетку.
Так что же это значит — вызвать LTP или long-term potentiation? Вот жила себе клетка, никого не трогала. Потом пришёл исследователь, её запэтчил, мембрану в месте присасывания порвал и начал потихоньку стимулировать, на что она нехотя, но отвечала ему стандартными импульсами. Потом он как взял и ударил её высокочастотным током в 100 Герц, да так, что она аж растеряла весь магний, который прикрывал её глутаматные рецепторы. И хлынул в эти просветы активизирующий всё и вся кальций, а клетка приобрела доселе невиданную мощь. И как только атака (или индукция) прекратилась, клетка силу свою не растеряла и впредь реагировала на обычные стимулы почти тем же самым усиленным образом.
Сегодня было ещё интереснее. Мы изучали пирамидные клетки гиппокампа, причём, не по одной, как в предыдущем случае, а сразу всем скопом, поставив на эту область 16-канальный электрод. А с другой стороны мы подвели стеклянный трубчатый электрод, дабы одновременно наблюдать за активностью какой-то одной клетки, которая была выбрана «лицом» всего процесса. А процесс этот назывался «гигантский деполяризующий потенциал».
Снова ругательство, подумаете вы, но я объясню. Мозг новорождённых крысят до 12-13 дня несколько отличается от взрослого мозга свойствами своих клеток. Точнее, их некоторой незрелостью. И если реакция обычных (взрослых или здоровых) клеток на гамма-аминомасляную кислоту (главную «тормозную жидкость») — это гиперполяризация мембраны и торможение потенциала (клетке становится труднее «родить» полноценный импульс), то новорожденные клетки, наоборот, активизируются под его началом и сообща «рожают» гигантские потенциалы. Заметьте, без всякой стимуляции. Это мы и видели. А потом «издевались» и вызывали у клеток эпилептический припадок с помощью специального вещества, которое затем вымывали и снова возвращали их к нормальной жизни.
«Зачем это всё делать?» — можете спросить вы. Но я могу ответить. Без таких экспериментов никак, ибо если мы не узнаем полностью всю физиологию нервной системы от одной клетки до целого мозга, то не сможем понять, где кроется нарушение, и, следовательно, его не вылечим. А это уже, без сомнения, ни в чьи интересы не входит. Вот и трудятся учёные-физиологи)
День 3: Нейробаррель “страдания”
Этот день, кажется, станет самым длительным по пребыванию в лаборатории. А «страдали» мы так долго и сильно, что начали сам эксперимент лишь в 5 часов после полудня. На самом деле «страдали» я взяла в кавычки именно потому, что было интересно так же, как сложно и трудоёмко, а наши остроумные наставники Дмитрий Сучков и Михаил Синцов на третьей установке «in-vivo» мастерски превратили всю возможную драму в юмористический этюд. За что им большое человеческое спасибо.
Я заинтриговала? Тогда добро пожаловать в мир живой бочонковой коры!
Итак, теперь обо всём по порядку. Мы учились регистрировать соматосенсорный ответ на движение уса в живом мозге сразу в двух располагающихся друг над другом структурах — таламусе и соответствующих слоях коры.
Дело в том, что весь путь сигнала от нашего прикосновения, скажем, к мягкой поверхности пледа, до непосредственно ощущения этого, проходит несколько этапов: от рецептора в коже до особых псевдоуниполярных нейронов в спинального ганглия, затем он «бежит» в соответствующий отдел продолговатого мозга, оттуда — в таламус, и уже из таламуса сигнал, наконец, приходит в кору. Каждый участочек нашей коры отвечает за свои особые функции. Есть область двигательная, а есть сенсорная, то есть та, которая несёт ответственность за чувствительность. Обе они имеют неравномерные проекции каждого участка тела: начиная большим пальцем на ноге и заканчивая кожей на макушке. У человека такие проекции художественно называют гомункулюсом, а у крыс, соответственно, ратункулусом. Но вообще в эксперименте мы работали с баррелами (бочонками) — ярко выраженными клетками четвёртого слоя колонки от одной вибриссы.
Баррелы находятся в четвертом слое колонки соматосенсорной коры и взаимосвязаны с соответствующими баррелоидами в таламусе. Так как наибольшей чувствительностью у крыс обладают вибриссы или усики, их проекции (а у каждого усика своя) в зонах мозга найти легче, так как они достаточно большие. Следовательно, в них легче попасть электродами (если знаешь, куда тыкать), чтобы затем стимулировать и изучать ответ.
Почему именно крысята? Многие проблемы на взрослых животных не возникают или проще решаются. С другой стороны, у крысят меньше других проблем, например с локализацией конкретной активности в барреле. Кроме этого, с крысятами в лаборатории работают, потому что изучаем соматосенсорную кору в развитии, то есть, в работе коры на разных возрастах, начиная с рождения. Крысята — это очень удобная модель. К тому же баррелы имеют достаточно большое представительство в коре.
Жизнь — боль
Но куда тыкать, мы знали как раз не очень хорошо, несмотря на все существующие карты мозга по возрастам. И не потому, что плохо понимали своё дело, а из-за огромного количества вариантов расположения таламуса, который внешне напоминает банан и по размеру не превышает 500 микрон. А вот теперь представьте, что банан может быть расплющенным, перевёрнутым, плоским или удлиненным, а крысёнок в свои 6 дней от роду — чуть больше или чуть меньше нормы. Плюс к этому банан может смещаться ближе к центральному шву или дальше от него, а ещё животное может шевелиться под наркозом, а в вашем манипуляторе — тончайший электрод стоимостью в тысячу баксов. Который может сломаться от одного лишь неточного движения пальца. И кровотечения никто не отменял — сердце работает, кровь бегает по сосудам, а мы всё-таки идём в живой мозг.
Прибавляем к этому возможную и чаще всего случайную криворукость самого учёного (человеческий фактор — обычное дело) и получаем на выходе «боль и страдание нейрофизиолога»: далеко не каждый эксперимент заканчивается удачей. .
Если хирургия и подготовка начинаются в 9 (крысёнка надо усыпить, оголить черепушку, «приклеить» холдер, который будет держать его голову неподвижно, «ввестись» в таламус в область баррелоидов именно усиков, а не губ и тела, понять, в какой усик попал, поставить оптический нейроимиджинг, чтобы посмотреть, какая зона коры активна в данный момент, просверлить череп над ней, ввестись электродом в кору, попасть в конкретный баррел — да так, чтобы он строго соответствовал найденному баррелоиду в таламусе), то сам эксперимент по записи данных под стимулирующими усик импульсами пьезокристалла начинается часов в 16-17 (запись идёт несколько часов). Если на пути у отважного и терпеливого (без этого никак) исследователя стало кровотечение, то запись начинается в 18. А если животное вдруг умерло (всякое бывает)… В общем, сами понимаете.
Но под радостные крики «ПОПАЛИ в ТАЛАМУС!» (на уровне А3) мы всё-таки ушли обедать около 14 часов, оставив крысёнка под огнями светодиодов, используемых в нейроимиджинге. Эта процедура представляет собой «чтение» активности коры по зелёному и красному спектрам окси- и дезоксигемоглобина, а также по ИК-излучению активных клеток, которые, по одной из рабочих гипотез, наполняются жидкостью больше своих пассивных соседей (вместе с ионами при деполяризации в клетку затягивается и вода). Собственно, прибор похож на разомкнутую диадему, сверкающую тремя типами огоньков, один из которых — ИК-диод — мы увидеть не в состоянии, но его видит камера нашего смартфона.
Вернувшись, мы обнаружили две активные зоны в коре, в которые и стали заводиться под пристальным вниманием кураторов. Надо же нам тоже дать возможность почувствовать мозг под электродом. У меня получилось попасть в колонку D4, а мои товарищи «потоптались» возле колонки D2 и соседней D3. Хотя все целились в C3.
Ну и на десерт с горящими глазами Дмитрий Сучков завёлся в вожделенный баррел А3. Такой восторг от получившегося эксперимента может испытать только истинный учёный.
Насладившись одновременным рисунком активности коры и таламуса (о, этот елей в глаза под 7 часов вечера!), мы внезапно обнаружили… что электрод в таламусе каким-то образом сместился из А3 в А2, где сигнал стал больше.
В общем, нашему «безудержному веселью» не было предела, а Диме пришлось прийти ещё и утром в воскресенье, чтобы завершить эксперимент. Суббота удалась для всех.
Источник информации: Анна Хоружая, Алексей Паевский
